PEAKS 提供 基于最新深度学习技术的先进谱库搜索功能，可从复杂的 数据非依赖分析（DIA）谱图 中鉴定肽段 ¹。由于 DIA 谱图包含 前体质量窗口内的离子信息，因此会同时收录多种肽段的碎片离子。这使得 DIA 谱图的复杂程度远高于 数据依赖分析（DDA）谱图。

为了从这类复杂谱图中准确鉴定肽段，谱图库 提供了一个 精炼的搜索空间：它将实验数据的 碎片离子模式、预期保留时间及其他区分特征，与库中已鉴定的谱图进行匹配。

借助 PEAKS 一体化软件，用户可在 同一平台完成全流程分析（从谱图库构建到谱库搜索），无需在 “项目结果转换” 和 “评分系统” 之间牺牲时间或精度。

灵敏准确的谱图库构建

谱图库搜索流程的第一步，是利用 数据依赖采集（DDA）质谱数据集 构建谱图库。

建议采用 分馏样品 构建谱图库，以实现研究物种的 最深蛋白质组覆盖度 ，并获得最多的肽段数。谱图库一旦建成，可用于 多次数据非依赖分析（DIA） ；因此，投入物料和仪器时间来构建一个全面的谱图库，往往是值得的。

随后，将该 DDA 数据导入 PEAKS 软件，利用 精准且灵敏的 PEAKS DB 蛋白质数据库搜索算法 进行检索。可通过 靶标 – 诱饵数据库搜索估算的假发现率（FDR） ，控制鉴定肽段的置信度阈值。随后，利用 高置信度鉴定的肽段 ，即可构建谱图库。

谱图库中的 每个肽段条目 ，都会承载来自 DDA 谱图的 关键信息 —— 这些信息为在复杂 DIA 质谱样品中鉴定该肽段，提供了最佳识别依据。

从全谱图中，会提取以下数据： 前体质量 、 离子淌度（若仪器支持） ，以及与该肽段匹配的 碎片离子强度和质荷比（m/z） 。此外，谱图库中每个条目的 保留时间（RT） 会被转换为 索引保留时间（iRT） ：iRT 通过软件 内置肽段库 生成，因此在构建谱图库和开展 DIA 分析时， 无需额外添加 iRT 标记肽 。

若质谱仪具备 离子淌度分离肽段 的功能，相关信息也会被纳入谱图库（需启用 PEAKS IMS 附加模块 ），进一步提升谱库搜索的灵敏度。

如何生成谱图库

Step 1 – Sample preparation: 蛋白质被酶解为肽段，随后这些肽段可进行分馏。

Step 2 – LC-MS/MS: 肽段通过数据依赖分析（DDA）进行分析，以生成谱图。

Step 3 – Library generation: DDA 数据通过 PEAKS DB 进行分析，并导出为谱图库，用于后续的 DIA 数据分析。

借助由深度学习驱动的保留时间预测算法，最大化谱库匹配率

谱库搜索本身使用起来非常简单。谱图库既可以在创建新项目前预先设置，也可以在谱库搜索参数设置过程中进行设置。

准备执行搜索时，只需将目标数据添加到项目中，选择谱库搜索工作流程，然后指定所需的谱图库并设置相应的搜索参数即可。

对于大规模蛋白质组学研究项目，推荐使用 PEAKS Online—— 它不仅能处理更大规模的样本队列，还能为这些全面的 PEAKS 谱库搜索提供一个高通量、可扩展的平台。

Figure 1. Relationship between experimental retention time (i.e. from DIA data) and indexed retention time (iRT) from the spectral library

PEAKS 采用基于机器学习开发的先进肽段特征检测算法，利用液质联用（LC-MS）信息预测样品中肽段的前体质量和洗脱曲线。

结合谱图库中的详细信息，以及基于深度学习开发的保留时间预测算法，可对所搜索的 DIA 数据集中谱图库肽段的洗脱时间进行预测。

谱图库中的肽段会与数据集中的肽段特征进行匹配，而匹配质量的评分则基于谱图库谱图与所搜索的相应二级质谱（MS/MS）谱图之间的拟合程度。

为确保结果的准确性，假发现率（FDR）通过诱饵谱图搜索进行预测（图 2）。

利用谱图库中的肽段，软件会生成打乱的肽段序列，同时将其相关的碎片离子列表也进行打乱，以构建诱饵谱图。因此，当执行谱库搜索时，软件所搜索的谱图库中，靶标谱图和诱饵谱图的数量是相等的。

基于结果中匹配到的谱图，可估算假发现率，并设置置信度阈值。关于 FDR 的更多细节，请参见我们的FDR tutorial.

结果是一份从 DIA 谱图中精确匹配到对应库谱图的肽段列表，作为鉴定依据。通过 FASTA 文件可推断出蛋白质，为鉴定结果提供生物学背景。

借助 PEAKS 易用的界面，谱库结果以图形化方式呈现（便于直观解读），并配有详尽的表格（供深入分析）。这些谱库结果可用于后续的定量分析。结果视图示例如下（图 3）。

Figure 2. The FDR can be calculated by dividing the number of hits, or identifications, made from the decoy database by the number of identified peptides (i.e., targets). The FDR can then we used to estimate how many false positives will be incorrectly included in the results.
Figure 3. Example of a peptide identified from a spectral library search using PEAKS Online

参考文献

  1. Tran NH, Qiao R, Xin L, Chen X, Liu C, Zhang X, Shan B, Ghodsi A, Li M. Deep learning enables de novo peptide sequencing from data-independent-acquisition mass spectrometry. Nat Methods. 2019 Jan;16(1):63-66. doi: 10.1038/s41592-018-0260-3. Epub 2018 Dec 20. PMID: 30573815.

Resources